70℃！BioTek的產(chǎn)品又雙叒叕火熱升級了！

核酸等溫擴增技術(shù)

    介紹LAMP技術(shù)前，我們先回顧一下核酸等溫擴增技術(shù)，相對于我們經(jīng)典熟知的聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)，等溫擴增可以在恒定溫度下快速有效地擴增核酸序列，并不需要復雜的熱循環(huán)以介導的變性、退火和延伸等步驟。目前，核酸的等溫擴增已成為一種極具應用前景的替代方法。

特異性的核酸等溫擴增技術(shù)通常包括：

·       環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)

·       依賴(lài)核酸序列的擴增技術(shù)(NASBA)

·       單引物等溫擴增（SPIA）

·       鏈置換擴增技術(shù)(SDA)

·       信號介導的核糖核酸 擴增技術(shù)(SMART)

·       依賴(lài)解旋酶的等溫擴增技術(shù)（HAD）

·       滾環(huán)擴增技術(shù)(RCA)

·       快速等溫檢測放大 技術(shù)(RIDA)

·       切刻內切酶核酸恒溫擴增（NEMA）

·       重組酶聚合酶擴增技術(shù) (RPA)

·       Cas酶的SHERLOCK和DETECTR技術(shù)

·       …等等

以上每種方法的引物設計、反應溫度及適合的檢測樣本都各不相同。

LAMP技術(shù)簡(jiǎn)介

    LAMP技術(shù)全稱(chēng)是Loop-mediated isothermal amplification（環(huán)介導的等溫擴增反應），是Notomi等在1998年報道的一種等溫核酸擴增技術(shù)，它屬于核酸等溫擴增技術(shù)家族的一員。

    LAMP技術(shù)需要4-6個(gè)引物，在恒溫65℃左右的條件下，這些引物能夠特異性識別模板DNA的6-8個(gè)DNA區間，每套LAMP引物中，包括一對具有回折結構的內引物（FIP和BIP）和一對用于置換單鏈產(chǎn)物的外引物（F3和B3），在具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶作用下，生成兩端具有環(huán)狀結構的啞鈴型中間產(chǎn)物，在內引物識別中間產(chǎn)物環(huán)狀區域引發(fā)延伸和回折結構和3′端自發(fā)延伸的雙重作用下擴增得到超長(cháng)串聯(lián)雙鏈DNA 擴增產(chǎn)物（如下圖所示）：

上圖：LAMP技術(shù)的原理示意圖，圖片來(lái)源：Loop-Mediated Isothermal Amplification | NEB

    LAMP反應過(guò)程中，核酸擴增釋放焦磷酸鹽和氫離子，降低了反應溶液的pH值，通過(guò)加入pH指示劑，可以通過(guò)顏色的變化評價(jià)檢測結果，另外，也可以通過(guò)加入DNA熒光探針，通過(guò)熒光強度檢測實(shí)現產(chǎn)物定量。

LAMP技術(shù)的主要特點(diǎn)

·對引物設計要求較高，目前有可以使用的LAMP引物設計軟件；

·檢測方法靈活，靈敏度高，可兼容現場(chǎng)快檢及實(shí)驗室高通量檢測；

·反應速度較快，一些商品化試劑盒，能夠在15mins內完成檢測；

·對于樣本DNA的純度要求較低，大大減少擴增前樣本純化工作；

使用LAMP技術(shù)開(kāi)展新冠病毒的檢測

    由于新型冠狀病毒SARS-CoV-2引起的新冠病毒肺炎全球大流行，嚴重危害人類(lèi)健康，對病毒的分子診斷產(chǎn)生了迫切需求及更高的要求，需要相關(guān)從業(yè)者以前所未有的規?？焖賱?chuàng )建準確和敏感的檢測方法，目前市場(chǎng)上雖然有不少數分鐘內的“快檢”的病毒試劑盒，但是大多無(wú)法實(shí)現高通量檢測，此外快速檢測為了追求時(shí)間縮短的同時(shí)，不可避免的犧牲了靈敏度。

    由于LAMP技術(shù)對樣本的前處理程度要求不高，并且可通過(guò)基礎的比色法進(jìn)行反應終點(diǎn)產(chǎn)物檢測，可實(shí)現快速高通量的樣本檢測，基于此技術(shù)的新的病毒檢測方法的開(kāi)發(fā)也愈發(fā)受到關(guān)注：

    2020年，來(lái)自我國山東濟南中心醫院、沈陽(yáng)化工大學(xué)應用生物學(xué)研究所、牛津大學(xué)蘇州高級研究中心等多家研究團隊陸續開(kāi)發(fā)出基于LAMP技術(shù)的新冠病毒現場(chǎng)快速檢測方法，濟南的研究團隊主要技術(shù)是在63℃等溫條件下，一步法進(jìn)行RNA逆轉錄和核酸擴增，30分鐘即可得到結果，同時(shí)檢測ORF1ab基因、E基因和N基因，有效率能達到99%，靈敏度在1000copies/mL；沈陽(yáng)化工大學(xué)的研究團隊采用了新型核酸染料GeneFinderTM作為L(cháng)AMP反應的終點(diǎn)指示劑，在藍光照射下進(jìn)行檢測，有效提高了檢測靈敏度；牛津大學(xué)蘇州高級研究院的研究團隊通過(guò)設計4組特定的LAPM引物，使用比色法進(jìn)行終點(diǎn)檢測，靈敏度可達到80copies/mL。

    以上這些研究者們開(kāi)發(fā)的SARS-Cov-2檢測方法都是基于肉眼的觀(guān)察法，優(yōu)點(diǎn)是可以實(shí)現現場(chǎng)快檢，但是無(wú)法開(kāi)展大規模高通量篩查，來(lái)自美國新英格蘭實(shí)驗室的團隊開(kāi)發(fā)出一整基于微孔板檢測儀的自動(dòng)化高通量的方案，可進(jìn)行96-384孔板體系的檢測，其引物設計針對病毒的N基因，As1e基因，N2基因和E1基因，并且他們經(jīng)過(guò)實(shí)驗發(fā)現，通過(guò)額外加入40mM的氯胍溶液，可以實(shí)現提高LAMP反應檢測靈敏度的作用，同時(shí)也縮短檢測反應時(shí)間，在65℃的條件下，反應時(shí)間縮短至 20分鐘以?xún)?。最終產(chǎn)物加入PH指示劑，在微孔板檢測儀上測定OD432nm和OD560nm的吸光度。

    該研究團隊還提出，可以采用Agilent的Bravo和 MultiFloFX進(jìn)行全自動(dòng)樣品前處理，采用定制的傳送帶孵箱進(jìn)行溫控（或選擇Thermo的全自動(dòng)孵育箱），最后采用BioTek(a part of Agilent)的SynergyNeo2進(jìn)行終點(diǎn)法檢測及數據處理，當然，如果不需要多板高通量處理，也可以選擇直接使用SynergyNeo2進(jìn)行溫控+檢測一步法~

上圖：基于LAMP技術(shù)的等溫擴增高通量終點(diǎn)檢測的自動(dòng)化工作流程示例

LAMP技術(shù)的其他應用

    由于LAMP技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)，目前在分子檢測和診斷方向有諸多應用場(chǎng)景及廣闊的應用前景，涵蓋了食品安全、醫療疾控、出入境檢驗檢疫、植物保護等多領(lǐng)域，例如免提取DNA步驟的葡萄藤紅斑病毒檢測、尿液樣本開(kāi)展寨卡病毒檢測、口蹄疫病毒檢測、轉基因成分檢測、過(guò)敏原成分檢測等等項目。

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BioTek的SynergyNeo2和SynergyH1溫控范圍提高至70℃!

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    作為藥篩大殺器SynergyNeo2，其本身已然具備高強武藝，而溫控范圍最高升級到70℃以后，能夠保證諸多等溫擴增反應溫度控制的精確性，特別是基于LAMP的實(shí)驗需要在65℃左右的溫度持續反應或檢測，如果您計劃開(kāi)展或者正在開(kāi)展核酸等溫擴增的相關(guān)研究，不妨了解一下BioTek產(chǎn)品的新功能，也許能事半功倍哦！

相關(guān)文獻：

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.02.20030130v2.full.pdf

RT‐LAMP for rapid diagnosis of coronavirus SARS‐CoV‐2 - Huang - 2020 - Microbial Biotechnology - Wiley Online Library

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.02.20.20025874v1.full.pdf

BioTechniques 69: 179–185 (September 2020) 10.2144/btn-2020-0078