精華預告：
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CD4+T細胞在細胞免疫治療中同樣重要
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體外CD4+T細胞的定向分化及擴增新策略
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活細胞成像是監測CD4+T細胞激活的重要方法
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利用表型觀(guān)測、mRNA表達、細胞因子分泌等多重檢測對Th17進(jìn)行功能評價(jià)
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Cytation5的成像與光信號檢測雙平臺提供以上實(shí)驗最優(yōu)檢測平臺
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免疫治療的新利器：Th17細胞
殺手T細胞在過(guò)繼性免疫治療中一直是最重要的研究對象，然而細胞毒性T細胞在體外擴增環(huán)節中的功能退化仍然是有待攻克的問(wèn)題。在T細胞家族中另一個(gè)非常重要的分支——輔助T細胞，近年諸多研究表明，CD4+ T細胞不僅發(fā)揮重要的免疫調節作用直接活化CD8+T細胞，還可以通過(guò)釋放IFN-γ等直接殺傷腫瘤細胞，因此在腫瘤免疫治療過(guò)程中應強調同時(shí)激活CD4+T和CD8+T細胞。
CD4+NaiveT細胞在接受APC細胞的信號激活后，受到環(huán)境中不同的細胞因子調節可分化至Th1, Th2, Th17等輔助T細胞和調節T細胞(Treg)。圖片來(lái)源：DOI: 10.1155/2014/928461
由于Th17細胞具有長(cháng)期自我更新、持久記憶能力的潛質(zhì)，它一直是自身免疫疾病研究關(guān)注的重點(diǎn)之一。但是，Th17之所以能成為我們今天故事的主角，還由于它在如今的腫瘤免疫治療領(lǐng)域也是風(fēng)生水起。這是因為Th17有著(zhù)令科學(xué)家非常著(zhù)迷的特點(diǎn)：亦正亦邪的可塑性。它既可以在特定的環(huán)境中發(fā)揮優(yōu)秀的抗腫瘤作用，也有著(zhù)可怕的促進(jìn)腫瘤生長(cháng)的分裂靈魂，近期也有研究發(fā)現其特征類(lèi)似干細胞：永生，不死，多面性。因此，Th17如同體內免疫大戰密網(wǎng)中的一個(gè)重要節點(diǎn)，如果搞清楚它的調控機制，那么則能夠掌握抗腫瘤戰爭的主動(dòng)權。
上圖展示了Th17細胞的可塑性。不同的細胞因子及信號調節作用下，其可通過(guò)多種途徑發(fā)揮促進(jìn)/抑制腫瘤生長(cháng)的能力。圖片來(lái)源：DOI: 10.1155/2015/314620
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體外Th17誘導分化
想好好的研究Th17細胞在免疫微環(huán)境中是怎么實(shí)現精分的，當然要先學(xué)會(huì )體外Th17的召喚術(shù)。傳統的體外T細胞激活和分化流程耗時(shí)耗力，今天介紹的方案是Lonza公司聯(lián)合BioTek公司推出的一套Th17定向分化及評價(jià)的解決方案。我們從Naive的T細胞入手，激活它，改造它。首先，外周血CD4+T細胞由Lonza公司傾情奉獻，而激活改造的方法是商品化的試劑盒：Miltenyi 的T Cell Activation/Expansion Kit，沒(méi)錯，只要買(mǎi)買(mǎi)買(mǎi)就可以了。
此前我們提到了T細胞的通用激活方法里包含一種通過(guò)特定材料制備的微珠、磁珠等方式，在其表面包被特定的表面抗原的抗體，用于模擬天然的抗原遞呈細胞，來(lái)激活初始T細胞。本方案里使用的也正是這種方式——MACSiBead?。
Step1:微珠裝載
1，將定量的100 μL CD2-Biotin、CD3-Biotin CD28-Biotin抗體 加入至2 mL 管子中并混合。
2，加入500 μL anti-biotin MACSiBead particles 并混合
3，加入200 μL PBS pH 7.2, 緩沖液混合將管子放置在 4℃ 2h并輕輕混合。
Anti-Biotin MACSiBead裝載完成可儲備使用
Step2:T細胞激活和分化
將裝載后的微珠和特定細胞因子誘導劑混合加入到培養CD4+T細胞的24或96孔板內，置于細胞培養箱內7天。
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T細胞激活和分化的多重評估
在這個(gè)方案中，我們可以選用三種方式來(lái)評價(jià)CD4+T細胞的激活和向Th17細胞分化的能力，分別從圖像表型分析、細胞內mRNA表達及細胞外因子分泌檢測來(lái)判斷我們的Th17召喚術(shù)效果如何。
NO1.活細胞表型分析
同上期方案一樣，激活后的CD4T細胞同樣會(huì )出現明顯的成團聚集擴增的現象，利用Cytation5的無(wú)標記成像，能夠準確清晰的記錄CD4+變身的過(guò)程。
上圖可以看出，右圖經(jīng)過(guò)激活后，T細胞抱團擴增。除了直觀(guān)的觀(guān)測到T細胞的激活狀態(tài)，采用活細胞成像監測的最重要的優(yōu)勢在于對細胞本身無(wú)標記且無(wú)侵入，能夠最大程度維持T細胞的活性，為后續的實(shí)驗流程提供保障。
No2. AlphaLISA檢測IL17的分泌
Th17細胞之所以被稱(chēng)作十七哥，正是因為它具有典型的標志性特征：能夠大量分泌IL-17細胞因子。所以我們的方案中是否成功誘導出具備功能性的Th17，自然離不開(kāi)對其分泌IL-17能力進(jìn)行定量檢測。
這種分泌型的小分子，最好的方法就是用均相的高靈敏度微孔板光信號檢測記技術(shù)了，比如HTRF,FP以及AlphaLISA等。
上圖展示了使用AlphaLISA試劑盒定量檢測激活分化后的T細胞培養基上清中的IL-17分泌。從標曲中計算可以看出，定向誘導分化組的IL-17的分泌整整提高了100倍。
NO3. 細胞水平mRNA檢測
雖然從細胞外分泌的IL-17的定量結果已經(jīng)基本證實(shí)我們定向誘導分化的Th17的功能性，但如果能夠得到每個(gè)細胞內IL-17合成的情況更好。因此在這里可以應用熒光原位雜交，而Affymetrix的ViewRNA技術(shù)通過(guò)核酸恒溫擴增的方式，極大提高了傳統FISH檢測的熒光信號，能在較低放大倍數下清晰成像到細胞內的多拷貝甚至單拷貝的mRNA。
上圖 在Cytation的20X物鏡下，Red: ACTB mRNA；Orange: IL-17FmRNA ；Blue: DAPI labeled nuclei 。通過(guò)Gen5的圖像定量分析，可以得到誘導分化組的細胞內IL-17 mRNA表達顯著(zhù)高于未分化組。
經(jīng)過(guò)里里外外的仔細鑒定，通過(guò)這個(gè)方案，能夠有效定向誘導功能性Th17細胞的擴增，當然，得到的這些細胞，就可以繼續用于后續的深入研究。
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小結一下
這個(gè)故事的主要目的是給大家提供一個(gè)體外細胞治療的研發(fā)策略的新的思路和技術(shù)路線(xiàn)，在抗腫瘤免疫治療的戰場(chǎng)中，不僅要發(fā)動(dòng)殺手T細胞，輔助T細胞同樣不能過(guò)，在這里我們通過(guò)成像觀(guān)測、細胞內IL17 mRNA表達、細胞外IL17分泌的多重檢測方式，可以全方面對Th17分化效果及功能進(jìn)行評價(jià)。
最后呢，恰好類(lèi)似我們今天提出的T細胞激活策略，同時(shí)擁有CMOS及PMT的Cytation5，不僅僅可以作為活細胞檢測系統監測T細胞的激活和分化，她的雙平臺檢測光路發(fā)揮的組合優(yōu)勢可實(shí)現包括基于成像的mRNA定量，以及基于激光光路的細胞因子Alpha檢測等，同時(shí)提供信號數據結果和圖像定量結果，這樣雙管齊下，分分鐘搞定各種T細胞~~
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