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 靶向RNA測序在融合基因檢測中的應用

融合基因是由染色體倒位、缺失和/或易位等基因組重排而發(fā)生的結構變異?；蛉诤峡赡芘c致癌特性相關(guān)，并可在多種癌癥類(lèi)型中驅動(dòng)腫瘤發(fā)生?；蛉诤蠈τ诎┌Y診斷和治療的重要性已得到廣泛認可，包括血液系統惡性腫瘤和實(shí)體瘤。臨床上使用多種技術(shù)來(lái)檢測基因融合，包括逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，使用融合探針或分離探針的熒光原位雜交 (Fluorescence in situ hybridization, FISH) 法等。前者檢測轉錄本的前提是斷點(diǎn)信息已知且目標位置集中在可擴增的區域內；后者則飽受復雜重排的挑戰。

二代測序（Next-generation sequencing, NGS）能夠在單個(gè)實(shí)驗中評估大量潛在的融合?；诎邢駾NA測序技術(shù)的大panel，通常覆蓋多基因的全外顯子、局部?jì)群优c部分啟動(dòng)子，能夠有效地檢出包含致癌融合在內的多種變異類(lèi)型¹。對常見(jiàn)或已知融合發(fā)生區鋪設探針并進(jìn)行雜交捕獲可檢測許多常見(jiàn)的激酶融合，包括涉及BRAF、ALK、RET和ROS1的融合，以及MET外顯子14跳躍突變。然而，這種基于DNA檢測基因融合的方法存在諸多技術(shù)限制。圖1列出基于DNA層面的分析可能導致融合檢測假陰性的原因。以NTRK3融合檢測為例，覆蓋其內含子并非有效方式，因其涉及基因組斷點(diǎn)的內含子13和14分別跨越93kb和92Kb。鋪設如此大的內含子將導致整體panel顯著(zhù)擴大，帶來(lái)成本增加及檢測靈敏度下降。其他原因還包括：內含子高度重復序列比對困難帶來(lái)了檢測盲點(diǎn)；RNA測序在腫瘤細胞占比低的情況下仍然可以檢測到高表達事件，DNA層面則影響較大；復雜的基因組重排導致序列比對或分析困難²。

圖1. 基因組復雜性或腫瘤豐度影響靶向測序融合檢測的示意圖²

靶向RNA測序專(zhuān)注于感興趣的基因序列（圖2），為轉錄本檢測和定量提供高靈敏度分析。在實(shí)體瘤基因融合檢測中，靶向RNA測序相比傳統方法（FISH或RT-PCR）對融合基因診斷率有顯著(zhù)提升。近期的兩項研究中該數值分別提升了13%³和22%⁴；在另一項兒童肉瘤的研究中，對RT-PCR融合基因測試呈陰性的樣本進(jìn)行測序分析，發(fā)現靶向RNA測序的結果可能影響其中27.8%病例的臨床管理，包括化療方案的改變，手術(shù)切除優(yōu)于化療，或整合靶向治療⁵。靶向RNA測序的另一個(gè)優(yōu)勢是通過(guò)探針/引物設計可檢測到新型融合基因^6,7，從而增加融合基因的檢測范圍——包括罕見(jiàn)的融合基因和新的基因伴侶。鑒于這些優(yōu)勢，靶向RNA測序越來(lái)越多地用于融合基因的檢測與分析。由于NTRK系列基因區域的復雜性，靶向RNA測序已被認為是鑒定NTRK融合的金標準⁸。

圖2. 靶向RNA測序的常見(jiàn)流程⁹

（a）針對目標基因的外顯子區鋪設寡核苷酸探針。(b) 探針雜交并富集感興趣的目標基因或區域。(c) 深度測序實(shí)現轉錄本組裝、表達量化和新轉錄本（或融合）的靈敏檢測。

僅使用靶向DNA測序分析融合的另一個(gè)缺點(diǎn)是，當檢測到新的結構變異時(shí)，較難確定此類(lèi)事件是否會(huì )導致功能性表達¹⁰。結合靶向DNA和RNA測序的綜合型基因組分析（圖3）可互為補充，有效檢測并驗證所有類(lèi)型的基因組改變，包括融合轉錄本。該方法在血液腫瘤中已被證明可識別存在于低至10~20%細胞中的融合轉錄本，并展示了染色體重排導致的框內融合轉錄本的功能與表達¹¹。實(shí)體瘤樣本進(jìn)行DNA和RNA同步NGS分析時(shí)，≥50ng DNA（≥3.3 ng/μl）和≥50ng RNA（最少7個(gè)拷貝/ng）的樣本投入量及≥10%的腫瘤細胞含量對高靈敏度檢測來(lái)說(shuō)是必要的¹²。靶向RNA測序對DNA層面的補充作用在另一項2,522例肺腺癌患者的隊列分析中得以證實(shí)：研究者發(fā)現靶向DNA測序呈驅動(dòng)變異陰性的患者有33例從RNA分析中發(fā)現了基因重排，且融合陽(yáng)性在低腫瘤突變負荷（tumor mutation burden, TMB）的陰性患者中相對富集¹³。

圖3. 結合靶向DNA和RNA測序的綜合型基因組分析

的工作流程¹⁴

腫瘤分子譜分析是精準腫瘤學(xué)的一個(gè)基本組成部分，其目的是識別基因和通路中的基因組變異，從而尋求臨床“可及性”——治療靶點(diǎn)或干預手段。靶向RNA測序，無(wú)論其本身用于融合檢測，還是作為靶向DNA測序的補充，均可協(xié)助識別更多具有治療意義的臨床相關(guān)變異。

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圖4. 羅氏靶向RNA測序方案

圖片來(lái)源：羅氏診斷整理

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圖5. 羅氏RNA靶向富集方案

圖片來(lái)源：羅氏診斷整理