合成生物學(xué)講述釀酒酵母合成大麻素的故事

合成生物學(xué)被稱(chēng)為將是又一次徹底改變世界的機會(huì )，是生物學(xué)工程化高度交叉的前沿學(xué)科研究領(lǐng)域。合成生物學(xué)技術(shù)的創(chuàng )新與應用，將會(huì )給我們現有生活帶來(lái)顛覆性的變化：想吃牛肉可以不用再養牛，想喝咖啡不用再種咖啡豆, 可以利用 DNA 當磁盤(pán)，可以依靠細菌實(shí)現環(huán)境治理… 聽(tīng)上去新奇而遙遠，然而，合成生物學(xué)已經(jīng)悄然來(lái)到我們身邊。

本期分享萜類(lèi)化合物生物全合成的經(jīng)典案例，來(lái)自中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物化學(xué)研究中心的羅小舟研究員等在Nature上發(fā)表的題為“Complete biosynthesis of cannabinoids and their unnatural analogues in yeast”的研究論文^[1]，為大家介紹利用合成生物學(xué)技術(shù)，以釀酒酵母為微生物工廠(chǎng)，半乳糖為原料，實(shí)現多種主要大麻素及其衍生物的生物全合成。

專(zhuān)家解讀核心信息

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復雜化合物的生物合成面臨諸多挑戰，需要將合成生物學(xué)方法與工程學(xué)手段相結合，利用生物自動(dòng)化設施，實(shí)現基于三重四極桿質(zhì)譜的對目標化合物及代謝中間體的高通量檢測；為解析異源底盤(pán)細胞工廠(chǎng)復雜的調控機制，利用高分辨率質(zhì)譜對底盤(pán)細胞進(jìn)行代謝組分析，從而實(shí)現代謝流的精準調控，最終實(shí)現天然及非天然化合物的高效生物合成。

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大麻素植株提取及化學(xué)合成的挑戰

大麻因其重要的藥用價(jià)值，在世界范圍內廣泛種植和使用，已經(jīng)有上千年的歷史。大麻素作為大麻中主要的一類(lèi)活性分子，在很多國家和地區，已是批準的處方藥，用來(lái)治療癲癇、慢性疼痛等多種疾病。但是，因為大麻的種植和交易在大部分國家和地區都是處于管制狀態(tài)，這極大的限制了其藥用價(jià)值的研究。此外，大麻素有著(zhù)超過(guò) 100 種不同的結構，大部分在天然植株中的含量都非常低，通過(guò)萃取提純十分昂貴；并且大麻素復雜的立體構型，也對大規模的化學(xué)合成帶來(lái)了很多挑戰。

本研究針對這些挑戰，巧妙的利用合成生物學(xué)技術(shù)在釀酒酵母中完成了大麻素生物合成途徑的異源重構，實(shí)現了包括大麻萜酚酸（CBGA）、四氫大麻酚酸（THCA）、大麻二酚酸（CBDA）在內的多種天然大麻素及非天然大麻素衍生物的生物全合成。

天然大麻素在釀酒酵母中的生物全合成

圖 1 | 釀酒酵母中大麻素生物合成途徑構建

研究者通過(guò)如下步驟實(shí)現了釀酒酵母中大麻素合成途徑的構建及重要天然大麻素分子的合成：

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對釀酒酵母自身的甲羥戊酸途徑進(jìn)行改造，引入外源基因并過(guò)表達該途徑上的關(guān)鍵酶，提高重要中間體香葉基焦磷酸的代謝流量。

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在該菌株中引入合成己酰輔酶A的代謝途徑，結合了來(lái)自多種不同物種的外源基因；同時(shí)引入了大麻中發(fā)現的另一個(gè)重要中間產(chǎn)物戊基二羥基苯酸（OA）合成的相關(guān)基因，實(shí)現了 OA 的生物全合成。

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隨后，通過(guò)生物信息學(xué)的方法，挖掘了數種植物的轉錄組或基因組，尋找能催化利用 OA 和 GPP 生成 CBGA 的關(guān)鍵酶。最終在大麻的轉錄組中挖掘出了一個(gè)編碼香葉基轉移酶（CsPT4）的基因并將其引入 GPP 和 OA 的高產(chǎn)菌株，最終實(shí)現了 CBGA 的生物全合成。通過(guò)在該菌種中引入對應的大麻素合成酶，完成了多種不同大麻素從半乳糖開(kāi)始的生物全合成。

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非天然大麻素及其衍生物的生物合成

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基于上述研究成果，研究者進(jìn)一步在培養基中添加不同的脂肪酸前體，分析了該代謝途徑上的數個(gè)酶的底物選擇性，發(fā)現這些酶可以利用多種不同的前體作為底物。于是通過(guò)添加或者生物合成不同的脂肪酸前體，實(shí)現了多種非天然大麻素的生物合成。

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利用該途徑，研究者在大麻素的分子結構中引入了生物正交的化學(xué)反應基團，并展示了可以通過(guò)合成化學(xué)對其結構進(jìn)行衍生化，進(jìn)一步提升了該類(lèi)化合物所能覆蓋的化學(xué)空間，進(jìn)而提高找到具有不同藥物活性、受體選擇性和藥物動(dòng)力學(xué)屬性的新型藥物的概率。該方法也能對大麻素作用機制的相關(guān)研究提供新型工具。

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質(zhì)譜分析檢測生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵代謝物

在生物合成過(guò)程中，對構建途徑的精確檢測極其重要：無(wú)論是目標產(chǎn)物的確定與含量檢測，還是外源途徑改造與宿主應答的分析，是優(yōu)化合成設計和確保目標結果的重要前提。本研究中，采用安捷倫 6210 TOF LCMS 及 6545 QTOF LCMS 系統對構建通路涉及的近 50 個(gè)中間代謝產(chǎn)物及終產(chǎn)物進(jìn)行了高效檢測。

圖 2 | 高分辨質(zhì)譜對構建途徑的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析

綜上所述，本研究通過(guò)在釀酒酵母中引入及改造超過(guò) 15 個(gè)來(lái)自不同物種的基因，實(shí)現了大麻素及其非天然衍生物的生物全合成，建立起一個(gè)生產(chǎn)天然及非天然大麻素的微生物工廠(chǎng)平臺，攻克了傳統植株提取存在的來(lái)源少、含量低、周期長(cháng)以及人工化學(xué)合成過(guò)程復雜等各種挑戰。本研究的成果為未來(lái)更廣泛的關(guān)于大麻素的相關(guān)研究提供了更方便的途徑，有望促進(jìn)針對多種人類(lèi)疾病的新藥研發(fā)。此外，本研究也建立起了萜類(lèi)化合物生物全合成的經(jīng)典案例，為未來(lái)合成生物學(xué)相關(guān)應用提供了重要的參考。

羅小舟帶領(lǐng)團隊完成的大麻素生物全合成的開(kāi)創(chuàng )性成果，引起了廣大投資團隊的興趣，成立了森瑞斯生物科技有限公司，搭建合成生物產(chǎn)業(yè)化平臺， 以實(shí)現多種高附加值化合物的高效生物合成。

參考文獻：

[1] Xiaozhou Luo, Michael A. Reiter,Jay D. Keasling et al,  Complete biosynthesis of cannabinoids and their unnatural analogues in yeast. Nature, 2019, 567:123.