POCT分子診斷開(kāi)發(fā)攔路虎 - 檢測試劑形態(tài)挑戰

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? POCT技術(shù)背景

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? 羅氏診斷工業(yè)原料

 POCT技術(shù)背景

近年來(lái)POCT技術(shù)（point-of-care testing）因其可即時(shí)檢測，快速出報告的特點(diǎn)，得到廣泛的關(guān)注和快速的發(fā)展。同樣POCT在分子診斷中的重要性正在迅速增長(cháng)，基因檢測也有了即時(shí)檢驗的需求。實(shí)現準確且快速的床旁檢測診斷，操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、反應快速、靈敏度高和對環(huán)境要求低是相關(guān)檢測產(chǎn)品所需達到的重要性能指標。

目前在新冠疫情的防控中，核酸檢測發(fā)揮了巨大作用，在即到即做、快速報告需求下，新冠病毒核酸POCT技術(shù)也應運而生。近日在《第三屆東方分子診斷學(xué)術(shù)會(huì )議》的“感染性疾病分子診斷論壇”上，發(fā)布了《病原體核酸即時(shí)檢測（POCT）質(zhì)量管理要求專(zhuān)家共識》。該《共識》從應用場(chǎng)景、生物安全管理、標本采集及預處理、性能驗證、室內質(zhì)控、室間質(zhì)評等方面形成了共識。其中關(guān)于性能驗證分別在符合率、精密度和檢測限三方面提出了具體的嚴格的要求。

POCT試劑相關(guān)原料要求

POCT檢測方案開(kāi)發(fā)時(shí)對靈敏度、檢測速度、抑制劑耐受性以及試劑保存運輸都有著(zhù)特殊的要求。并且為了達到即時(shí)檢測快速出報告的目的，POCT試劑開(kāi)發(fā)時(shí)大多都選擇了室溫保存和運輸的技術(shù)路線(xiàn)。相關(guān)試劑盒運輸無(wú)需冷鏈，極大的提高了便利性并降低了對環(huán)境的要求，與此同時(shí)對于相關(guān)原料的選擇也提出了新的要求。

首先為了達到室溫穩定儲存的要求，POCT試劑盒大多選擇了凍干的技術(shù)路線(xiàn)，這就要求相關(guān)試劑提供無(wú)甘油包裝，并且可在無(wú)甘油條件下穩定存儲；其次為了達到快速出報告的需求，POCT試劑簡(jiǎn)化甚至是省略了核酸提取的環(huán)節，不可避免的會(huì )將樣品中抑制物引入到PCR檢測環(huán)節，這就要求核心檢測試劑有較強的抑制劑耐受性能；同樣為了快速出報告的需求，需加快PCR循環(huán)的進(jìn)程，減少PCR整體反應時(shí)間，這同樣也要求相關(guān)核心酶類(lèi)可以應對快速PCR需求；最后分子POCT檢測操作簡(jiǎn)便，降低了對實(shí)驗人員操作的要求，與此同時(shí)卻大大加大了開(kāi)發(fā)難度，但對檢測性能的要求沒(méi)有減少，即與傳統檢測應該有著(zhù)一樣的檢測靈敏度和檢測性能。

羅氏診斷工業(yè)原料

羅氏診斷工業(yè)原料提供的AptaTaq DNA聚合酶、同時(shí)具有逆轉錄和聚合酶活性的HawkZ05 Fast聚合酶系列可以提供高濃度、不含甘油的包裝形式。酶的性能也能保證反應液在凍干過(guò)程和隨后的貯存過(guò)程中的穩定性，在凍干前后顯示相同的高性能（圖1），為檢測方法的設計提供更大的靈活性。

圖1：對于新配制的預混液以及干燥劑型（在 37℃下貯存 2、6 和 16 周后）進(jìn)行平行試驗，比較 AptaTaq DNA 聚合酶在干燥及保存后的 PCR 性能。在96孔板上干燥 AptaTaq DNA 聚合酶與 PCR 引物和探針。反應前加入水并添加 DNA 模板后，使用實(shí)時(shí)熒光 PCR 測定 Cp 值。圖片來(lái)源：Roche R&D 實(shí)驗數據。

AptaTaq DNA聚合酶、HawkZ05 Fast聚合酶均屬于寡核苷酸適配體修飾的熱啟動(dòng)酶，具有溫度依賴(lài)性三級結構（圖2）。

圖2：寡核苷酸適配體-酶混合物是一個(gè)可逆的，溫度依賴(lài)性熱啟動(dòng)系統 。適配體作為分子開(kāi)關(guān)用于聚合酶的激活。通過(guò)在較低溫度下，寡核苷酸適配體與聚合酶緊密結合，實(shí)現酶活性抑制。將溫度降至+55°C以下，聚合酶活性關(guān)閉；在高于+60°C 的溫度，聚合酶活性實(shí)現完全活化。圖片來(lái)源：羅氏診斷收集。

與化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)酶不同，適配體修飾無(wú)需熱啟動(dòng)時(shí)間，這樣每次運行可節省多達10-15分鐘的時(shí)間，加快檢測進(jìn)程；同樣與基于抗體的封閉方法也不同，適配體相對于抗體對溫度變化更不敏感，因此可在更劇烈的溫度下保持穩定，保證其對Taq酶的封閉效果；另外非常重要的是寡核酸適配體可以作為Taq酶的一種穩定劑，極大的增加Taq酶在常溫下甚至更高溫度下的穩定性，降低產(chǎn)品對冷鏈的依賴(lài)。

另外羅氏診斷工業(yè)原料提供的NxtScript家族是一種突變設計的逆轉錄酶，在越來(lái)越高的溫度下選擇性的朝熱穩定性進(jìn)化。NxtScript 2G逆轉錄酶是該系列的最新成員，它將逆轉錄步驟的溫度提高到了新的水平：即使在70℃時(shí)活性也不會(huì )損失。能夠輕松檢測困難的RNA靶標，在較高溫度下，RNA二級結構會(huì )打開(kāi)，不再阻止擴增。能夠應對高GC含量區域，酶的熱穩定性不再限制解鏈溫度。靈活的凍干即用型試劑，輕松地將NxtScript 2G RT整合到反應優(yōu)化中，可以單獨凍干或與其它試劑混合。并可提供濃度≥500U/μl無(wú)甘油形式（圖3）。同時(shí)NxtScript 2G RT也有一定的耐受抑制能力，無(wú)論是處理困難的樣品類(lèi)型，還是通過(guò)減少樣品制備流程來(lái)縮短獲得結果的時(shí)間，都可以獲得可靠的結果。

圖3：將在存儲液中的NxtScritp 2G RT直接凍干，無(wú)進(jìn)一步優(yōu)化，與保留的新鮮組進(jìn)行測試。凍干樣品的性能顯示活性沒(méi)有損失。圖片來(lái)源：Roche R&D 實(shí)驗數據

用于開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)床旁檢測產(chǎn)品的羅氏診斷工業(yè)原料產(chǎn)品，擁有應用于POCT的豐富的凍干型產(chǎn)品組合和一站式服務(wù)。在位于德國的高科技機構中進(jìn)行生產(chǎn)，并可根據您的個(gè)人需求進(jìn)行定制型生產(chǎn)。

用于POCT檢測產(chǎn)品的羅氏可凍干原料產(chǎn)品

羅氏診斷工業(yè)原料部門(mén)提供從樣品制備、分子擴增和檢測所需的高質(zhì)量專(zhuān)業(yè)原料產(chǎn)品，滿(mǎn)足您特定要求的快速分子診斷床旁檢測產(chǎn)品的需求。