解碼中藥配方顆粒 | 從質(zhì)量標準研究到標準方法重現，超實(shí)用色譜“柱”你選擇！

配方顆粒中色譜柱的使用概況
由于中藥配方顆粒已經(jīng)不具備中藥飲片性狀鑒別的特征，故特征（或指紋）圖譜成為表征藥材飲片到配方顆粒成品全過(guò)程質(zhì)量一致性、相關(guān)性和量值傳遞規律的主要手段。特征圖譜采用相對保留時(shí)間（RRT）、相對峰面積進(jìn)行控制，要求所有特征成分分離良好，因此對色譜柱的分離性能、重現性、耐用性要求很高。已頒布的 160 個(gè)中藥配方顆粒國家標準中，全部品種均采用了液相特征（或指紋）圖譜的方法，色譜柱主要為 C18 柱，部分品種或檢項采用了 HILIC、氨基和苯基己基柱。從品種液相分析方法看，160個(gè)品種，其中的 89 個(gè)品種采用了超高效液相色譜（UHPLC）方法，UHPLC 使用超過(guò)一半。

Agilent 色譜柱在配方顆標準中的應用

特征/指紋圖譜

在已公布的國家標準中，四十多個(gè)品種使用到了Agilent 的色譜柱。其中不封端、側鏈保護的 Zorbax Stable Bond 系列最常用（12 個(gè) UHPLC 和 5 個(gè) HPLC）；其次封端 Zorbax系列色譜柱（Eclipse XDB及Plus C18）也得到了廣泛應用；另外，TC/HC-C18 系列色譜柱在常規 HPLC 中方法適用性也很廣泛。

含量測定除少數方法外，含量測定方法一般未標注使用的色譜柱品牌，因此，幾乎所有品種均可以選擇 Agilent 的色譜柱來(lái)完成定量分析。HPLC 方法，選擇 Zorbax 系列（如 SB/Plus/XDB-C18）或 TC/TC(2)-C18 系列。UHPLC方法，選擇Zorbax RRHD Plus/SB-C18或 SB-AQ，也可選擇Poroshell系列色譜柱。含量測定需要滿(mǎn)足系統適應性要求，必要時(shí)通過(guò)柱篩選系統（或色譜柱選擇性差異比較）來(lái)確定色譜柱。應用實(shí)例之女貞子配方顆粒

系統適應性要求：特女貞苷理論塔板數 N>4000色譜柱替代Zorbax 品牌下的 SB/Plus/XDB/Extend 等系列 C18 色譜柱，具有通用性強、批次穩定、耐用、選擇性好等特點(diǎn)，可以用于替換標準方法中相同規格的非安捷倫的 HPLC 和 UHPLC 色譜柱。Poroshell 系列色譜柱，可以用來(lái)替代標準方法中表面多孔型填料的 UHPLC 色譜柱。常規 HPLC 中，還可以選擇對應尺寸的 TC/TC(2)-C18 色譜柱來(lái)完成特征圖譜和含量測定。應用實(shí)例之杜仲配方顆粒

使用 Zorbax RRHD SB C18，RRT 完全滿(mǎn)足標準要求
應用實(shí)例之魚(yú)腥草配方顆粒

使用 TC-C18 色譜柱，RRT 及含量測定完全滿(mǎn)足標準要求
方法重現的問(wèn)題
配方顆粒特征圖譜和含量測定中，最為常見(jiàn)的問(wèn)題有相對保留時(shí)間（RRT）不符合要求、相對峰面積不滿(mǎn)足要求、系統適應性中理論板數低、溶劑效應、分離度達不到要求、峰形和峰數量存在差異、保留時(shí)間不穩、峰干擾、儀器之間存在差異等?？赏ㄟ^(guò)排查：色譜柱選擇性、色譜柱性能狀態(tài)、流動(dòng)相方法、儀器系統管路、色譜柱連接、樣品問(wèn)題、溶劑、溫度等方面來(lái)解決問(wèn)題。

配方顆粒新方法建立中的色譜柱選擇在新的國標方法或省級標準方法建立中，可以按照以下原則來(lái)選擇合適的色譜柱。

UHPLC 方法中的色譜柱選擇配方顆粒品種多、批次多、檢驗量大，UHPLC 方法成為首選。新建 UHPLC 方法時(shí)優(yōu)先選擇 1.8 μm 的 Zorbax Plus-C18 和 SB-C18 色譜柱（封端和不封端的 C18 鍵合相的代表），在特征圖譜和含量測定方法中通用性非常極強。對于極性較強的成分，優(yōu)先選擇 SB-C18 或 SB-AQ 色譜柱；另可選 1.9 μm 或 2.7 μm 的 Poroshell 系列色譜柱。

普通 HPLC 方法中的色譜柱選擇從最通用的色譜柱開(kāi)始，包括 Zorbax SB-C18、XDB-C18、Plus-C18、TC/TC(2)-C18等。使用 Poroshell 4 μm 色譜柱，可實(shí)現更好的分離度、柱效要求。另外，選擇 SB-AQ用于增加極性成分的保留、選擇 Polaris C18-A 用于選擇性改善和增加保留。

快速 HPLC 方法中的色譜柱選擇
中藥成分極其復雜，建立快速高效、耐用、易于重現的配方顆粒方法尤為重要。普通 HPLC 儀器系統，可以采用上表 3-4 μm粒徑 150 mm 柱長(cháng)色譜柱，來(lái)建立快速 HPLC 方法。另外，選擇 Poroshell 2.7 μm 系列色譜柱，在較低壓力（<400bar）體系下，建立快速的 HPLC 方法 。

色譜柱選擇性差異C18 色譜柱用得最多，但并非所有 C18 色譜柱分離結果都一樣，其中封端和不封端、極性修飾等帶來(lái)的選擇性差異非常顯著(zhù)。因此，利用色譜柱選擇性差異改善分離度是最簡(jiǎn)便的辦法。在配方顆粒的特征圖譜或含量測定中，不封端的 SB-C18、封端的 XDB/Plus C18、TC-C18 成為最通用的色譜柱。Poroshell 系列色譜柱中，四種 C18 固定相涵蓋了典型的固定相選擇性差異要求。關(guān)于色譜柱選擇性差異的比較，可以參考疏水減法模型（HSM）中相似度因子Fs的計算，來(lái)比較不同色譜柱之間的相似（Fs<3）或差異(fs>3)程度^[1]。

極性組分分析的色譜柱選擇
反相模式配方顆粒來(lái)源于飲片的水提物，可檢出組分（如有機酸、核苷、核苷酸、水溶性維生素、生物堿等）極性較強，色譜柱選擇可以使用 SB-C18、SB-AQ、Polaris C18-A 等，這些色譜柱可以從 100% 的水相開(kāi)始進(jìn)行梯度淋洗?；蚩蛇x擇苯基柱或五氟苯基柱等用于保留增強或選擇性改變。流動(dòng)相可以考察水相比例、pH、緩沖體系、離子對試劑等。親水作用色譜（HILIC）模式強極性成分，例如關(guān)注配方顆粒中的葡萄糖、果糖、蔗糖、甜菜堿等強極性成分，可以使用 HILIC 色譜柱搭配 ELSD 來(lái)完成特征圖譜或含量測定。在配方顆粒質(zhì)量控制方法中， Poroshell 系列的 HILIC-Z 色譜柱最為推薦，該 HILIC 固定相上采用帶有陰陽(yáng)兩性離子鍵合，具有非常強的親水作用和靜電作用力，pH 耐受范圍寬（1-12），能耐受高溫（80℃,pH<7時(shí)）。

應用實(shí)例之白術(shù)配方顆粒中果糖蔗糖的含量測定

氨基酸檢測
含有氨基酸的配方顆粒，或動(dòng)物藥品種，可通過(guò)氨基酸種類(lèi)及其比例進(jìn)行指標性測試。氨基酸的檢測方法可采用 HILIC 模式直接分析（建議搭配 ELSD 或 MSD）之外，還可以利用柱前衍生再反相檢測的方式來(lái)完成氨基酸的高靈敏度檢測，參考 Agilent 自動(dòng)柱前衍生方法^[2]。生物堿的分析生物堿通常作為特有成分存在藥材飲片和配方顆粒中。生物堿分析通常存在峰形異?；虮Ａ糨^弱問(wèn)題。色譜柱選擇封端的 Zorbax Plus-C18 或 Poroshell EC-C18 或 HPH-C18 等，或使用表面帶正電荷的 C18 柱如 Poroshell CS-C18 來(lái)改善峰形。流動(dòng)相中可添加 TEA、TFA 等來(lái)改善峰形和保留。

延長(cháng)色譜柱壽命的耗材
由于樣品基質(zhì)的影響，色譜柱容易損壞，為了更好地保護色譜柱，延長(cháng)色譜柱的使用壽命，并獲得更好的分析結果，提高實(shí)驗室效率，推薦下列耗材在 HPLC 和 UHPLC 中搭配使用。